Mis primeros pasos en Biología Molecular.

Hola a tod@s.
Desde el 25 al 28 de abril pasado, tuve el privilegio de poder asistir a un "Curso de Iniciación a la Biología Molecular", organizado por la asociación de MicobotánicaJaen, en la localidad Cordobesa de Priego de Córdoba, impartido por el maestro Tomás Illescas Ferrezuelo.
En el evento tuve el placer de poder conocer en persona a nuestro presidente Demetrio Merino Alcántara, al gran maestro Miguel Ángel Ribes Ripoll, a Agustín Sierra Sierra y a Francisco Sánchez Iglesias, el curso contó además con la participación de otros compañeros de la asociación como Juan Francisco Moreno Gámez, Victoriano Delgado Cecilia, Dianora Estrada Aristimuño,  Vicente José Escobio García y Concha Morente Díaz, así como otros miembros ya de otras asociaciones Micológicas, como Francisco Javier Donaire Sánchez (SIM), Mariano Romera Muñoz (Chiclanera), Francisco Fernández Parreño (Muscaria), Juan Manuel Ramos Infante (Micelio) y Juan Carlos Blanco Gómez.
A todos ellos Muchas gracias, por hacer del Curso unas veladas inolvidables.
Para hacer mis primeros pasos en este campo he escogido una Russula que tengo pendiente desde 2020.
Pongo una resumida descripción de la misma:
Un solo ejemplar, recogido el 26 de septiembre de 2021 (principios de Otoño), con unas coordenadas aproximadas de la geolocalización de 42º10’19’’N 1º10’23’’E. en un punto bastante cercano a la pequeña localidad de Bóixols (Lleida).
Sombrero convexo con tendencia a aplanarse, de unos 8 cm. de diámetro, cutícula viscosa de color amarillo más oscuro en el centro, con algunos tintes verdosos.
  Láminas densas en un primer momento blancas, para adquirir tonos marfíl por el efecto de la esporada.
Cutícula prácticamente nada separable, sin ningún olor apreciable y un sabor tanto de la carne como de las láminas de un acre ardiente y persistente.
Pie notablemente ensanchado en su base pero sin un bulbo diferenciado, con carne prieta y densa de color blanco, con una longitud parecida a la del diámetro del sombrero.
 

No reacciona de manera evidente con el Fenol ni con el KOH, tampoco con el Sulfato ferroso (FeSO4).
Esporada en masa de color amarillo (IVb - IVc en la escala de Romagnesi).
 

 Microscopía:
En un exámen preliminar no me pareció observar dermatocistidios claramente diferenciados en el píleo, (esto lo podrás comprobar en las imágenes), solo me pareció observar algunas hifas primordiales incrustadas.
Las hifas en agua.
 

Sin embargo utilizando la Sulfovainillina, en las imágenes si parecen verse en la pileipellis elementos terminales septados que bien se podrían corresponder a dermarocistidios, esto ya nos llevaría a la sección Sanguininae donde se encuentran la Russula queletii, la Russula torulosa, la Russula sardonia, etc., etc., 
Suprapellis en Sulfovainillina a 400 aumentos.
 

Suprapellis en SV a 1000 aumentos.
 

Pleurocistidios muy abundantes en la cara laminar, de gran tamaño, lanceolados con contenido granuloso en su interior.
 
 

Queilocistidios asimismo abundantes con una morfología parecida a los pleurocistidios, algunos de ellos mucronados.
 
 

Basidios de un tamaño relativamente pequeño considerando el género, con unas medidas de  44.64 - 49.6 × 10.5 - 11.7 µm, y tetraspóricos, este dato nos confirma además que encaja bastante bien con una Violaceinae.
 

 Basidiosporas entre subglobosas a ovoideas, con una marcada apícula, ornamentadas con verrugas bajas dispersas que se unen formando crestas, aunque en ningún momento un retículo completo, estas esporas al Melzer con unas medidas de:
(6.8) 7.2 - 8.1 (8.5) × (5.8) 6.1 - 6.9 (7.3) µm.
Q = 1.1 - 1.2 (1.3) ; N = 30
Me = 7.6 × 6.6 µm ; Qe = 1.2
 

Como no pude llegar a ninguna conclusión medianamente razonable acerca de su identidad, decidí probar con el análisis molecular con el resultado de ITS =  99.69% Russula sp. KJ668591, 96.26% R. queletii KT934007, LSU = ok, 99.31% Russula queletii KT933868, y rpb2 = ok, 98.46% Russula aff. queletii KX813661.
Como tengo del todo claro que mi Russula no se corresponde para nada con la Russula queletii, decidí probar de confeccionar el árbol filogenético.
Seguimos............................................

En primer lugar utilizando el programa de BioEdit, suprimí los picos dobles del inicio y del final de la secuencia.
 
Aquí tuve que realizar la reversa ya que mi secuencia se encontraba en sentido inverso.
Luego ya la puse en el "Blast", aquí seleccioné la opción de "More dissimilar sequences" para que el resultado no fuera un monográfico de pocas especies.
En este paso escogí al azar 19 secuencias que me parecieron interesantes.
 

El documento de texto del resultado del Blast.
 

Aquí toca reemplazar los espacios por "guion bajo" y sacar la información innecesaria.
 

Secuencias sin un Clado externo, en el programa BioEdit.
 

Toca ya proceder con el alineado, para esta función he utilizado la página de Mafft, después del alineado toca suprimir la secuencias demasiado largas correspondientes probablemente a otros genes, dejo el resultado con la zona a eliminar.
 

Ahora toca reemplazar los guiones del principio y fin de las secuencias por interrogantes, para ello utilicé el programa AlliView.
 

Para confeccionar ya el árbol filogenético, utilicé el programa de PhyloSuite, y dentro de este la extensión IQ-TREE
 

Con el resultado en formato .contree, solo tuve que abrirlo con el programa de FigTree.
He aquí el resultado de mi primer "árbol filogenético".
 

En el árbol aunque geneticamente mi Russula se encuentra cerca de la Russula queletii ya la coloca en un Clado distinto, se puede ver en la parte superior de la imágen.
En cuanto vaya averiguando nuevos datos, seguiré ampliando la información en este mismo hilo.
Saludos.
 

Para poder precisar un poco más, he decidido probar con 20 Russulas, en este intento con Russulas ya más cercanas molecularmente a la mía, como Clado externo he utilizado la secuencia de un Lactarius que a pesar del análisis molecular sigo dudando entre helvus y pallidus, he aquí el resultado.
 
Aquí mi Russula (la 1919_21), además de la CM29-18S, se encuentra muy cerca de otras tres (línea gruesa dentro del mismo Clado).
Este árbol debo considerarlo como bueno ya que coincide con uno que me obsequió mi maestro Tomás Illescas, él utilizó 40 Russulas, sin un clado externo, dejo el resultado.
 

Las 4 secuencias (dentro del recuadro), son las mismas que aparecen en mi segundo árbol filogenético.

Ahora toca probar con el gen LSU.
Seguiré informando.
Saludos a tod@s.
 

La información obtenida con la elaboración del árbol filogenético del gen LSU, no aportó casi nada nuevo, en un primer intento con 24 Russulas escogidas al azar, próximas a la de mi estudio y utilizando como clado externo una Russula de la República Dominicana, el resultado fue pero que muy decepcionante.
 

Llegado a este punto ya decidí prescindir del clado externo.
 
Aquí mi Russula se sitúa muy cercana molecularmente a la Russula queletii, por lo que ya decido probar de nuevo con 40 Russulas, en este caso ya todas muy cercanas molecularmente a mi propuesta y utilizando como clado externo la Russula umerensis..
 
El resultado prácticamente calcado al de mi árbol anterior.

Ya llegado a este punto decido probar suerte con el gen rpb2, utilizando como clado externo a la Russula candida, este gen especialmente en el caso de los basidiomicetos, generalmente te acerca un poco más a la especie, el resultado tampoco fue nada alentador.
Árbol filogenético del gen rpb2.
 
Aquí mi Russula la emparenta con una tal Russula aff. queletii, ya de nuevo elaboro un nuevo árbol con las 30 Russulas más parecidas a mi propuesta, utilizando como clado externo a la Russula intermedia.
 
El resultado ha sido calcado al del árbol anterior.

Conclusión: Partiendo de la base de que mi propuesta aceptando que puede encontrarse molecularmente muy cerca de la Russula queletii, tengo del todo claro que no puede tratarse de esta por múltiples razones, la Russula queletii ya en el aspecto macroscópico presenta siempre tonos violáceos o vinosos, especialmente en el pie, además del color de la esporada en masa que en mi caso es amarilla (IVb-IVc) y en el caso de la Russula queletii debería se de color crema (IId), en cuanto al hábitat la Russula queletíi, aunque puede aparecer bajo coníferas, se asocia especialmente a Picea, y aunque las medidas esporales coinciden, ya no lo hace la morfología esporal, con verrugas dispersas sin llegar a formar crestas en al caso de la Russula queletíi.
Parece evidente que solo disponemos de información en el caso del gen ITS, donde la sitúan dentro de un grupo con 4 Russulas, todas como Russula sp. la KJ668591.1, la KF871217.1, la OR378289.1 y la PP533049.1, solo queda intentar ponerme en contacto con sus autores, por si pueden aportar algo al respecto.
O ya muy a pesar mío, no me quedaría mas remedio que archivarla como lo más parecido, es decir Russula aff. queletii.

Seguiré informando.

Saludos a tod@s. 

Gracias Javi, a medida que vaya adquiriendo práctica ya iré presentando cosillas 
Un abrazo